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Die Identifizierung von Genen, die die Entwicklung bei Fliegen und Fischen steuern (Nobel-Vortrag)
Von Christiane Nüsslein-Volhard
Im Lebenszyklus von Tieren kommt es zu einem Wechsel zwischen
komplexen und einfachen Formen. Ein Tier entwickelt sich aus einer einfach
strukturierten Eizelle, die keine Ähnlichkeit mit der hochorganisierten Gestalt
der Larve oder der Adultform zeigt. Der Prozeß der Embryonalentwicklung,
bei dem wohlgeordnete Zunahme an Komplexität mit perfekter Reproduzierbarkeit
einhergeht, wird nur von einem kleinen Teil aller Gene gesteuert. Tiere haben
eine sehr große Zahl von Genen, die genaue Zahl kennt man jedoch bei keinem
multizellulären Organismus. Ebenso wenig ist bekannt , wie viele und welche
Gene für die Entwicklung von Komplexität, Form und Gestalt während der Embryogenese
erforderlich sind. Ein Hauptanliegen der biologischen Forschung ist es, diese
Gene zu identifizieren und ihre Funktionen zu verstehen.
Gene können durch Mutationen entdeckt werden, durch Änderungen
also, die ihre Funktion beeinträchtigen. Verglichen mit anderen experimentellen
Ansätzen ist die Analyse von Mutationen ganz besonders leistungsfähig, wenn
die Rolle einzelner Komponenten in der Entwicklung zu untersuchen ist: Nur
eine Komponente, das Genprodukt, entfällt oder wird verändert, während der
übrige Organismus intakt bleibt. Aus dem Phänotyp der Mutante kann auf die
Funktion des Gens geschlossen werden, da man anhand der Mutante studieren
kann, wie sich das Tier ohne das primäre Genprodukt entwickelt. Der Mutante
Phänotyp ist damit sehr wichtig für das Verständnis der Funktion eines Gens.
Gene mit ähnlichem Phänotyp haben oft ähnliche Funktionen zu erfüllen, und
ihre Produkte nehmen meist an dem gleichen Entwicklungsprozess teil.
Mutationen treten selten spontan auf, ihre Häufigkeit kann jedoch
durch den Einsatz von Röntgenstrahlen oder Chemikalien, die die DNA-Sequenz
verändern, gesteigert werden. Diese Eigenschaft wurde zuerst genutzt, um
systematisch nach Mutationen zu suchen, die einige Prozesse bei Bakterien
und Pilzen beeinflussen (1-3). Mutationen, die sich auf Entwicklungsprozesse
bei Drosophila melanogaster auswirken, wurden zunächst mehr oder weniger
zufällig gefunden, erstmalig 1922, als Bridges die Mutante bithorax entdeckte
(4). Zudem war eine kleine Zahl embryonaler Mutanten, z.B. notch, von Poulson
und Mitarbeitern detailliert beschrieben worden (5). In den siebziger Jahren
wurde damit begonnen, systematischer nach Mutanten zu suchen. Brenner identifizierte
beim Fadenwurm C.elegans Mutationen, die das stereotype Entwicklungsmuster
der postembryonalen Entwicklung verändern (6). Lewis am California Institute
of Technology fand Mutationen, die homöotische Transformationen im adulten
und im Larvenstadium von Drosophila hervorrufen(7). 1979 hatten Eric Wieshaus
und ich am European Molecular Biology Laboratory (EMBL) in Heidelberg Methoden
entwickelt, um im großen Maßstab nach embryonal letalen Mutationen bei Drosophila
zu suchen. Dabei konzentrierten wir uns vor allem auf das segmentierte Muster
der larvalen Epidermis (8). In diesen und späteren Mutagenese-Experimenten
wurden eine Reihe von Genen entdeckt, die schon in einem frühen Stadium der
Embryonalentwicklung eine Funktion haben und für die Bildung einer morphologisch
normalen Larve notwendig sind(9-11). Ähnliche Experimente in anderen Labors
führten zur Identifizierung von Genen, die maternal exprimiert werden und
deren Produkte schon im noch unbefruchteten Ei vorhanden sind und die Expression
zygotischer Gene kontrollieren (12-16). Die anschließende Analyse der Phänotypen,
die molekulare Klonierung ihrer vieler dieser Gene und die Untersuchung der
Wechselwirkungen ihrer Produkte führten zu einem inzwischen relativ vollständigen
Gesamtbild der Mechanismen, die die anteroposteriore und die dorsoventrale
Achse des frühen Embryos bestimmen (17-19). Diese Mechanismen sind ein nützliches
Paradigma für die Entwicklung komplexer Formen aus einer einfachen Eizelle.
Drosophila ist eine Fliege und hat als solche ganz besondere
Eigenschaften. Sie ist nicht mehr oder weniger "speziell" als ein Wurm oder
Frosch, aber in vielerlei Hinsicht sehr verschieden von diesen Lebewesen.
So war es nicht von vornherein klar, in welchem Maß die bei Drosophila gewonnenen
Erkenntnisse verallgemeinert werden könnten und welche dieser Erkenntnisse
uns beim Verständnis der Entwicklung anderer Tiere, insbesondere der von
Wirbeltieren, weiterhelfen würden. Unser Wissen über die Wirbeltier-Embryogenese
basierte hauptsächlich auf Experimenten mit Fröschen (20) und Hühnern und
nur zu einem kleinen Teil auf genetischen Ansätzen. Wegen ihrer geringen
Größe und des erforderlichen osmotischen Innendrucks, unter dem sich Drosophila-Embryonen
entwickeln, sind Gewebetransplantationen, wie sie bei Frosch- und Hühnerembryonen
durchgeführt wurden, bei Drosophila fast unmöglich. Eine systematische Suche
nach Mutanten, die für die Analyse komplexer Prozesse sehr wünschenswert
ist, ist dagegen bei den meisten Wirbeltieren sehr problematisch. Deshalb
waren Beschreibung und Verständnis der Entwicklung von Tieren bei diesen
beiden Stämmen - Arthropoden wie Drosophila sowie Wirbeltieren wie Frosch,
Huhn, Maus und Mensch - auf so unterschiedlichem Niveau, daß lange Zeit ein
Vergleich zwischen ihnen fast sinnlos schien. Die Entwicklung der Methode
mit rekombinanter DNA und damit das Klonieren von Genen im großen Stil ermöglichte
dann aber den Vergleich von Genen aus unterschiedlichen Organismen auf der
Grundlage von DNA- und Proteinsequenzen. Zwei wichtige Erkenntnisse resultierten
aus diesen Untersuchungen:
1.
Die biochemische Funktion der Drosophila-Genprodukte konnte in vielen Fällen
abgeleitet werden, indem man ihre Aminosäuresequenzen mit denen verwandter
und gut charakterisierter Proteine aus anderen Organismen, wie Säugetieren,
Bakterien oder Hefen verglich. Dabei wurde klar, daß viele der Komponenten,
die die Entwicklung kontrollieren, zu gut bekannten Proteinklassen, wie Transkriptionsfaktoren,
Proteinkinasen, sekretierten Signalmolekülen oder Rezeptoren, gehören.
2.
In vielen Fällen war die Ähnlichkeit zwischen den Proteinen von Drosophila
und denen von Wirbeltieren nicht nur auf ihre biochemische Eigenschaften
beschränkt, sondern erwies sich als eine echte Funktionshomologie innerhalb
der Entwicklung. Diese Homologie zeigt sich sowohl in ähnlichen Expressionsmustern
als auch in den Phänotypen, die man nach Ausschalten der Genfunktion durch
homologe Rekombination bei Mäusen erhielt. Diese Untersuchungen führten zu
dem überraschenden Schluß, daß die grundlegenden Merkmale er Körperorganisation,
z.B. die Spezifizierung entlang der anteroposterioren Achse und die Polarität
der Gastrulation, in Organismen unterschiedlicher Tierstämme offensichtlich
konserviert sind (21,22). Diese Konservierung deutet auf die Existenz eines
gemeinsamen Grundbauplans hin, der von gemeinsamen Vorfahren, den in de Evolution
ersten bilateralsymmetrisch aufgebauten Organismen, stammt.
Die Untersuchung von Genen, die wegen ihrer Homologie zu Drosophila-Genen
entdeckt wurden, ist mittlerweile einer der erfolgreichsten Ansätze, um die
Kotrolle der Vertebratenentwicklung auf genetischem Niveau zu verstehen.
Obwohl die elegante Methode der homologen Rekombination bei Mäusen die Einführung
von Mutationen in die chromosomale Kopie jedes zuvor klonierten Gens ermöglicht
(23), kann man nicht vorhersagen, welche Gene in der Entwicklung unverzichtbar
sind und einen informativen Phänotyp bei "Knock-out"-Mäusen ergeben. Ein
wichtiger Grund für den Erfolg der Homologie-Untersuchung ist, daß die relevanten
Gene von Drosophila nur eine kleine Auswahl der Gene eines Tieres sind, die
durch Mutagenese-Experimente selektiert und als wichtig und unverzichtbar
für die Entwicklung erkannt wurden. Ihre Homologen bei Wirbeltieren haben,
wie bei Mäusen gezeigt, ebenfalls häufig nicht-redundante Funktionen (24).
Verfahren, die auf der Homologie zwischen Invertebraten und Vertebraten
beruhen, konzentrieren sich auf konservierte Eigenschaften, wobei gegen Merkmale,
in denen sich diese Tiere unterscheiden, selektioniert wird. Wirbeltiere
haben während der Evolution spezifische Strukturen und neue Mechanismen erworben.
Um Gene zu identifizieren, die für solche Funktionen benötigt werden, ist
es notwendig, Mutagenese-Experimente direkt an einem Vertebratenorganimus
vorzunehmen. In vielen Labors wurden deshalb Methoden erarbeitet, um mit
dem Zebrafisch als Modellorganismus die genetische Kontrolle der Embryonalentwicklung
bei einem Wirbeltier zu analysieren (25-28).
In diesem Vortrag möchte ich die Drosophila-Mutagenesen und ihre
wichtigsten Ergebnisse, aber auch ihre Grenzen diskutieren. Ich möchte diese
mit den Ergebnissen einer groß angelegten, von uns kürzlich durchgeführten
Suche nach Mutationen, die die Entwicklung des Zebrafisches beeinflussen,
vergleichen.
Die Suche nach Mutanten bei Drosophila
Drosophila hat als Modellorganismus für genetische Studien der
Entwicklung eine Tradition und ist eines der am besten erforschten Tiere
(30). Außerdem hat sich Drosophila für das Studium der Embryonalentwicklung
als sehr gut geeignet erwiesen. Einige Eigenschaften von Drosophila sind
in Tabelle 1 aufgelistet. Die kleine Zahl an Chromosomen ermöglichte die
Entwicklung vieler genetischer Hilfsmittel, z.B. von Balancer-Chromosomen
mit vielfältigen Inversionen, die die Rekombination verhindern, von sichtbaren
Markern, die die Suche nach vorhandener oder nichtvorhandener mutanter Nachkommenschaft
erlauben, und von konditional letalen oder sterilen Mutationen, die Selektionssysteme
möglich machen. Diese Hilfsmittel waren in der systematischen Suche nach
Mutationen, die zur Letalität oder Sterilität führen, unschätzbar (Abb.1).
In Verbindung mit unserem Wissen über Riesenchromosomen, die ein physikalisches
Maß für die Zahl von Genen sind, kann bei Drosophila relativ ganau die Zahl
der Gene bestimmen, die für Überleben und Fruchtbarkeit benötigt werden.
Mutationen in ungefähr 5000 Genen sind für den Organismus letal. Die für
die Fruchtbarkeit notwendige Zahl an Genen ist nicht so genau bestimmt, ist
aber wahrscheinlich nicht größer als 1000. Die Gesamtzahl aller Gene, definiert
als Transkriptionseinheiten, ist dagegen viel größer und liegt bei ungefähr
20 000. Das bedeutet, daß bei Drosophila die meisten Gene keine unverzichtbaren
Funktionen haben. Ungefähr ein Drittel aller letalen Mutationen führt dazu,
daß Embryonen nicht schlüpfen können (embryonale Letalität), doch ungefähr
10% aller embryonal letalen Mutationen führen zu einem leicht sichtbaren
und spezifischen morphologischen Phänotyp der nicht geschlüpften, aber schon
ausdifferenzierten Larven.
Die Drosophila-Larve weist eine klar erkennbare Organisation
der Achsen mit vielen deutlichen Zeichen von Zellposition und Polarität auf,
die durch die externe Citiculahülle der larvalen Epidermis geliefert werden
(Abb.2). Die Epidermis der Larve nimmt einen großen Teil des embryonalen
Anlageplans ein, während das übrige Blastoderm vor allem zu inneren Organen
wird, die im lebenden Embryo weniger deutlich sichtbar sind. Während für
die larvale Epidermis eine sehr gute und einfache Fixierungsmethode zur Verfügung
steht, gab es zum Zeitpunkt der Mutagenese-Experimente keine effiziente Methode,
um die durch den opaken Dotter verdeckten inneren Organe sichtbar zu machen.
Dieses Problem ist inzwischen überwunden, da eine große Zahl molekularer
Sonden und Antikörper entwickelt worden ist, die dazu genutzt wurden, Mutanen
zu suchen, wenn auch in jedem dieser Mutagenese-Experimente nur nach einem
relativ beschränkten Spektrum von Phänotypen gesucht werden konnte. Die Eigenschaften
von Drosophila und ihre Vorzüge für die genetische Analyse der embryonalen
Musterentwicklung sind in Abbildung 1 zusammengefasst.
Durch die Mutagenesen, die in Heidelberg durchgeführt wurden
(9-11), identifizierten wir Mutanten, die durch einige, signifikante Abweichungen
vom normalen Muster der Cuticula erkennbar waren. Diese Mutanten definierten
in ergänzenden Tests ungefähr 130 Gene, die statistisch auf den drei Hauptchromosomen
verteilt waren. Unter Verwendung ähnlicher Kriterien wurden in mehreren Labors
maternale Mutanten gefunden, die etwa 30 Gene definieren (12-16). Ohne molekulare
Marker konnten zu diesem Zeitpunkt die meisten mutanten Phänotypen nur schwer
analysiert und interpretiert werden. Wir nutzten deshalb pragmatische Kriterien
für das Screening und die Charakterisierung der embryonalen Mutanten. Anhand
der Ähnlichkeit mancher Phänotypen konnten mehrere Gruppen von Genen erkannt
werden, die wahrscheinlich die gleichen oder verwandte Entwicklungsprozesse
beeinflussen. Spätere phänotypische und genetische Analysen, gefolgt von
der molekularen Klonierung der Gene , bestätigen in vielen Fällen diese Annahme.
Die durch das Screening der Mutanten identifizierten Gengruppen sind in Tabelle
2 gezeigt.
Während unserer Mutagenese-Experimente legten wir großen Wert
auf Vollständigkeit, d.h. wir versuchten, das Genom mit Mutanten zu sättigen,
die wir gemäß unserer Kriterien auffinden konnten. Hinweise, wie die Allelhäufigkeit
und der Vergleich mit Phänotypen der Deletionsmutanten, bestätigen unsere
Vermutung , daß die Mehrzahl der Gene, deren Mutation zu einem in der larvalen
Cuticula sichtbaren Phänotyp führt, in unseren Mutagenese-Experimenten auch
gefunden worden war. Die Suche nach maternalen Mutanten war aufwendiger und
schwieriger als die nach embryonal letalen Mutanten, da eine zusätzliche
Generation durch Inzucht hergestellt werden mußte. Daher ist es wahrscheinlich,
daß der Grad der Saturierung für maternale Gene nicht so hoch war wie für
zygotisch exprimierte Gene. Obwohl durch die Mutagenese-Experimente viele
wichtige Gene identifiziert worden waren und obwohl die Untersuchung weiterer
Linien die Zahl der entdeckten Gene nicht signifikant erhöht hätte, waren
wir uns doch bewußt, daß unser Ansatz eine Reihe nicht unerheblicher, intrinsischer
Beschränkungen aufwies.
Genetische Redundanz
Zur
damaligen Zeit hielten die meisten Drosophila-Genetiker Gene, deren Mutation
nicht zur Letalität oder Sterilität führen, für nicht erforschenswert. Man
nahm an, daß die Mehrzahl aller Gene für Überleben und Fruchtbarkeit notwendig
wären. Redundanz und duplizierte Gene wurden erst später zu einem Diskussionsthema,
weil sie die physikalische Isolierung eines Gens durch Klonieren voraussetzen,
während in der "Vorklonier-Epoche" ein Gen nur dann auffindbar war, wenn
die Mutation einen Phänotyp hervorbringt. Dennoch berücksichtigten wir Redundanz
als Möglichkeit. In der Klasse der Segmentierungsgene wurden in einigen Fällen
zufällig Genduplikationen während molekularer Analysen entdeckt. Da Methoden
der reversen Genetik nicht generell bei Drosophila anwendbar sind, kann der
Anteil redundanter Gene dupliziert werden. Es ist völlig unklar, warum manche
Gene dupliziert werden und andere nicht.
Maternaler und zygotischer Anteil von Genen
Eine weitere Einschränkung, die wir für wesentlicher hielten,
war, daß Gene, deren Produkte sowohl maternal als auch zygotisch erforderlich
sind, bei Mutagenesen schwierig zu entdecken sein würden. Ist das Genprodukt
maternal vorhanden, wäre es möglich, daß der zygotische Phänotyp nicht den
vollständigen Funktionsmangel aufweist. Dieses Problem gab es besonders bei
den maternalen Mutanten: In Fällen zusätzlicher Funktionen im Embryo könnten
Mutantionen in Genen mit wichtigen maternalen Funktionen zygotisch letal
und deshalb in maternalen Mutagenese-Experimenten nicht auffindbar sein.
Dies bestätigte sich in manchen Fällen. Auch heute noch lassen sich Gene,
die sowohl maternal als auch zygotisch erforderlich sind, nicht leicht genetisch
identifizieren.
Achsenbestimmung bei Drosophila
Ein großer Teil der Gene, die sowohl bei den maternalen als auch
bei den zygotischen Mutagenesen identifiziert wurden, beeinflussen entweder
die anteroposteriore oder die dorsoventrale Achse. Das Muster der Larve besteht
aus einer Reihe von Segmenten, die sich von der anterioren nach der posterioren
Seite allmählich ändern. An beiden Enden gibt es nichtsegmentierte, terminale
Strukturen. Das larvale Muster weist auch deutliche Unterschiede entlang
der dorsoventralen Achse auf, auch wenn sich die ventralsten (Mesoderm) und
dorsalsten Strukturen (Amnioserosa) des embryonalen Anlageplans nicht im
epidermalen Muster wiederfinden.
Die anteroposteriore Achse
Wir definierten drei Klassen zygotischer Segmentierungsgene,
die wir Gap-, Pair-rule- und Segmentpolaritätsgene nannten (8). Bei Gap-Gen-Mutanten
fehlen jeweils große Bereiche des Embryos. In Pair-rule-Mutanten sind homologe
Regionen in jedem zweiten Segment der Larve betroffen (Abb.2), während bei
Mutanten der Segmentpolaritätsklasse Defekte in jedem Segment der Larve auftreten.
Diese Phänotypen zeigten, daß der Prozeß der Segmentierung in mindestens
drei Stufen abläuft: Zuerst werden durch Prozesse, die während der Oogenese
beginnen, große Bereiche definiert, die die Funktion der Gap-Gene benötigen.
Die Gap-Gene wiederum kontrollieren ein sich wiederholendes Muster periodisch
aufeinanderfolgender Doppelsegmente. Anschließend, als Folge der Aktivität
der Pair-rule-Gene, werden die einzelnen Segmente als definierte Einheiten
innerhalb der Entwicklung festgeschrieben (8).
Die molekulare Analyse der Eigenschaften und Funktionen der Segmentierungsgene
wurde in vielen Labors durchgeführt. Bei diesen Untersuchungen erwies sich
die von Alan Spradling und Gerald Rubin entwickelte Methode zur Herstellung
transgener Fliegen durch P-Element-induzierte Keimbahn-Transformationen als
ein sehr vielseitig verwendbarer Ansatz (31). Viele der Segmentierungsgene
kodierten Transkriptionsfaktoren, die die Expressionsdomänen anderer Segmentierungsgene
kontrollieren, und zwar innerhalb derselben oder innerhalb einer der nachgeschalteten
(downstream) Genklassen. Das Expressionsmuster vieler Segmentierungsgene
ähnelt dem Deletionsmuster, das sich in der Cuticula widerspiegelt (18).
Während der frühen Embryogenese wird eine Reihe solcher molekularer Vormuster
gebildet, die aus den Expressionsdomänen von Transkriptionsfaktoren, Produkten
der Segmentierungsgene, zusammengesetzt sind. Die Gap-Gene werden während
der frühen Embryogenese in großen definierten Bereichen exprimiert; ihr Expressionsmuster
wird von maternalen Transkriptionsfaktoren bestimmt (18). Das früheste metamere
Muster, das der Pair-rule-Gene, zeigt 7 Streifen, von denen jeder durch die
Wirkung und Wechselwirkung einer Kombination aus Gap-Gen-Produkten festgelegt
wird (32,33). Die Pair-rule-Gene kontrollieren das Muster der mehr als 14
Streifen, die der Bildung des morphologischen Musters, d.h. er Segmente,
vorausgehen (Abb.3) (34).
Identifizierung und Analyse der maternalen Gene, die das Segmentierungsmuster
bestimmen, ergaben, daß die anteroposteriore Achse von drei Gengruppen kontrolliert
wird. Jede dieser Gruppen legt, unabhängig von den beiden anderen, nur einen
Teil des Musters fest: entweder die segmentierten, anterioren oder posterioren
Teile oder die nichtsegmentierten, terminalen Bereiche des Embryos (35-37).
Obwohl die molekularen Mechanismen, durch die diese drei Gengruppen ihre
Funktion ausüben, sich zum Teil stark unterscheiden, haben sie auch einige
Gemeinsamkeiten: Ein Beispiel hierfür ist die Entstehung lokaler Signale,
die sowohl am anterioren als auch am posterioren Pol des Eis lokalisiert
sind. Außerdem führt in jeder Gruppe eine Reihe molekularer Wechselwirkungen
zur Bildung eines Transkriptionsfaktor-Gradienten, der die höchste Konzentration
an der Stelle des lokalisierten Signals aufweist und einen beträchtlichen
Teil der Eilänge einnimmt (Abb.2) (38). Diese Transkriptionsfaktor-Gradienten
legen die die Expressions der Gap-Gene in einer konzentrationsabhängnigen
Weise fest und führen dadurch zu einer ersten Untergliederung des Embryos.
Die Dorsoventral-Achse
Zwei Klassen zygotischer Gene wurden identifiziert, bei denen
Mutationen zu einem dorsalisierten oder ventralisierten Phänotyp führen (39).
Bei Drosophila entsteht das Mesoderm während der Gastrulation im ventralen
Bereich des Eis. Die Mesodermbildung hängt von der Expression zweier zygotischer
Transkriptionsfaktoren, die man entlang der anteroposterioren Achse beobachtet,
findet die Feinunterteilung auf der dorsalen Seite des dorsoventralen Musters
durch einen weitreichenden Signalübertragungsprozeß statt (40). Die maternale
Kontrolle des dorsoventralen Musters wird von nur einer Gruppe von Genen
ausgeführt, die die Bildung eines Gradienten der Kernlokalisierung eines
Transkriptionsfaktors bewirken. Dieser Transkriptionsfaktor, der sowohl als
Repressor von dorsal exprimierten Genen fungiert, ist am stärksten in ventralen
Kernen angereichert (17,19). Dieses erste zygotische Expressionsmuster unterteilt
den Embryo in mindestens drei Domänen entlang der dorsoventralen Achse.
Die molekularen Mechanismen der Musterbildung
Trotz der bereits angesprochenen Einschränkungen bei der Suche
nach Mutanten scheint die Sammlung identifizierter Gene in einer phänotypischen
Klasse und damit in einer Entwicklungskaskade vollständig zu sein. In einigen
Fällen wurden die molekularen Wechselwirkungen der Komponenten in einer Signalkaskade
oder zwischen unterschiedlichen Signalwegen detailliert aufgeklärt. Diese
Beispiele haben gezeigt, wie komplexe Muster als Folge eine kleinen Zahl
unabhängig voneinander lokalisierter Signale entstehen können. Ein prinzipieller
Mechanismus, durch den das Maß an räumlicher Komplexität erhöht werden kann,
basiert auf Konzentrationsgradienten von Morphogenen, Substanzen, die je
nach Konzentration unterschiedliche Antworten hervorrufen können. Ein solcher
Mechanismus wurde entdeckt, als die maternale Kontrolle des Expressionsmusters
des Gap-Gens hunchback durch das Protein Bicoid untersucht wurde (41-43).
Bicoid ist der Transkriptionsfaktor, der die anteriore Musterbildung bestimmt.
Im Ei ist Bicoid als Konzentrationsgradient verteilt, mit maximalen Mengen
am anterioren Pol des Eis. Das Bicoid-Protein kontrolliert dort die Transkription
unterschiedlicher Zielgene in konzentrationsabhängiger Weise. Solche Morphogengradienten
können durch Diffusion eines Proteins entstehen, wobei das Protein von einer
lokalisierten mRNA-Quelle translatiert wird. Beispiele hierfür sind die anterioren
und posterioren maternalen Gradienten (Abb.2) (35,37). In anderen Fällen
entstehen Gradienten offensichtlich durch Diffusion von Molekülen im extrazellulären
Bereich (44). Durch einen Signaltransduktionsmechanismus, der auf einer Liganden-Rezetor-
Wechselwirkung beruht (45), wird die räumliche Verteilung des Gradienten
an das innere der Eizelle weitergegeben. Im Fall der dorsoventralen Achse
führt dies dazu, daß ein Gradient des ursprünglich gleichmäßig verteilten
Transkriptionsfaktors Dorsal in Zellkernen aufgebaut wird (46,47). Während
der Segmentierungsphase entwickelt sich eine ganze Reihe von Vormustern mit
zunehmender räumlicher Komplexität. Diese Muster entstehen durch konzentrationsabhängige
Aktivierung oder Inaktivierung der Transkription, wobei oft Kombinationen
aus Transkriptionsfaktoren eine Rolle spielen (18). Die Festlegung des endgültigen
molekularen Vormusters hängt von lokal begrenzten Signalprozessen zwischen
benachbarten Zellen ab (34,48). Dieses Vormuster ist die direkte Vorstufe
zu den ersten morphologisch sichtbaren Veränderungen, die während der Segmentdifferenzierung
stattfinden.
Problematik der Drosophila-Mutagenesen
Zum jetztigen Zeitpunkt gehören die Mechanismen, durch die die
Achsen bei Drosophila festgelegt werden, zu den am besten verstandenen Beispielen
für Musterbildung. Wegen einiger Besonderheiten der Frühentwicklung im Drosophila-Embryo
existieren allerdings nicht immer enge Parallelen zu anderen Tierstämmen.
Diese Einschränkung gilt besonders für Prozesse, die die Diffusion in einem
synzytialen Embryo erfordern, wie die Bildung des Bicoid-Gradienten. Doch
könnten bei Drosophila Analogien zu Musterbildungsprozessen in vielzelligen
Geweben bestehen: Mögliche Beispiele hierfür sind die Bildung von Gradienten
durch Diffusion in den Zellzwischenräumen, Prozesse der Signalübertragung
und die Bildung eines Kernlokalisierungs- Gradienten, wie im Fall von Dorsal.
Die genetische Analyse der Musterbildung bei Drosophila hat uns Informationen
über den Ablauf der Musterbildung in einem komplexen System geliefert. Sie
hat auch zur Aufdeckung einiger grundlegender Mechanismen geführt, die eine
Zunahme an Komplexität während der Entwicklung multizellulärer Organismen
ermöglichen. Doch sind viele Aspekte der Entwicklung bei Tieren, besonders
die Bildung von Organen und deren Funktionen, bei Drosophila nicht sehr genau
untersucht worden. Der Grund hierfür ist, daß wir bei unseren Mutagenesen
das epidermale Cuticulamuster beim Auswerten mutanter Phänotypen nutzten.
Zwar war uns diese Einschränkung bewußt, doch war sie auch von Vorteil, weil
sie durch strenge Kriterien die Zahl der Gene begrenzte, mit denen wir uns
auseinandersetzen mußten. Viele Mutationen konnten aber durch das Auswerten
des Cuticulamusters allein nicht gefunden werden. So ist bis heute bei Drosophila
kein systematisches Screening nach Mutanten mit Defekten der inneren Organe
durchgeführt worden. Jedoch wurde eine reihe von Genen, die Funktionen bei
der Bildung der inneren Organe haben, in speziellen Mutagenesen mit spezifischen
molekularen Sonden identifiziert (49) oder auch durch andere Methoden, wie
die sehr wichtigen "Enhancer-trap"-Ansätze (50,51).Tabelle 2 zeigt eine grobe
Klassifizierung der Drosophila-Gene, die im Laufe der in Heidelberg durchgeführten
Mutagenesen gefunden wurden. Bis heute wurden mehr als 60% dieser Gene kloniert.
Viele Drosophila-Gene haben Vertebraten-Homologe. Die Homologie
beschränkt sich nicht auf die Aminosäuresequenz und auf die biochemische
Funktion der Proteine, sondern umfaßt auch die biologische Rolle, die die
Proteine während der Entwicklung spielen. Diese bemerkenswerte Konservierung
war völlig überraschend und war weder vorhergesagt noch erwartet worden.
Einen der ersten Hinweise lieferte die Entdeckung der hox-Gen-Komplexe bei
Wirbeltieren und die Konservierung der Colinearität ihrer Expressionsdomänen
mit ihrer Lage auf den Chromosomen (22,52). Schon bald wurden die Vertebraten-Homologe
anderer Homöobox-Gene identifiziert, und inzwischen scheint es wahrscheinlich,
daß ein großer Teil der Drosophila-Gene, die wir während unsrer Mutagenesen
gefunden haben, Homologe bei Wirbeltieren haben. Der genaue Anteil läßt sich
bisher nur schwer abschätzen, weil nicht in allen Fällen nach Homologen gesucht
wurde, doch könnte es von Bedeutung sein, daß bis jetzt von maternalen Genen
nur sehr wenige Vertebraten-Homologe gefunden wurden (Tabelle 2). Dies könnte
die großen Unterschiede widerspiegeln, die man während der Frühentwicklung
von Vertebraten und Invertebraten beobachtet.
Viele der Vertebraten-Homologe von Drosophila-Genen spielen eine
wichtige Rolle bei der Musterbildung der Maus. Wichtige Signalwege scheinen
konserviert zu sein, wie der Signaltransduktionsweg der TGF-ß-ähnlichen Wachstumsfaktoren
und der der Homologen der Gene hedgehog und wingless (21, 53, 54). Die meisten
der Komponenten solcher Signalwege wurden identifiziert, weil sie einen im
segmentierten Muster der Drosophila-Larve sichtbaren Phänotyp haben. Bei
der Bildung des Wirbeltierkörpers wirken diese Gene aber nicht immer im gleichen
Zusammenhang. So nehmen Gene, die bei der Segmentierung von Drosophila eine
Rolle spielen, sowohl bei Drosophila als auch bei Vertebraten an der Musterbildung
des Gehirns und der Extremitäten teil. Obwohl die Gesamtheit der Drosophila-Gene,
die eine Rolle bei der Musterbildung spielen, eine wichtige Quelle für die
Untersuchung einiger Aspekte der Vertebratenentwicklung ist, handelt es sich
um eine ausgewählte Gruppe, die wahrscheinlich nur einen kleinen Teil der
Gene enthält, die die Musterbildung im Wirbeltierembryo kontrollieren. Will
man eine möglichst vollständige Sammlung dieser Gene erhalten, muß man direkt
bei einem Wirbeltier Mutagenesen durchführen und nach Mutationen suchen.
Mutagenesen beim Zebrafisch
Der Zebrafisch Danio rerio wurde vom inzwischen verstorbenen
George Streisinger als potentieller Modellorganismus für genetische Untersuchungen
gewählt (28). In den letzten zwanzig Jahren wurde eine ganze Reihe nützlicher
Methoden entwickelt, einerseits um die Haltung und genetische Analyse des
Zebrafisches zu ermöglichen, anderseits um seine Embryonalentwicklung zu
untersuchen (25-27). Es ist interessant, Fliegen und Fische in ihren Eigenschaften
für genetische und embryonale Untersuchungen zu vergleichen. Die lange Generationszeit
und der Platzbedarf zur Aufzucht von Zebrafischen machen es schwierig, groß
angelegte Mutagenese-Experimente durchzuführen. Außerdem ist das Halten von
Fischen wegen technischer und logistischer Probleme beim Betreiben einer
großen Zahl von Aquarien teurer und arbeitsintensiver als das von Fliegen.
Doch haben Zebrafische gegenüber Mäusen, den für genetische Untersuchungen
traditionell verwendeten Wirbeltierorganismen, den Vorteil der extrauterinen
Entwicklung und der hohen Nachkommenzahl. Bei Fischen sind außerdem Invitro-Befruchtungen,
die Entwicklung haploider Embryonen bis zum Larvalstadium, Diploidisierung
und auch das Einfrieren von Spermaproben möglich (Tabelle 1). Diese Techniken,
die es für die Fliege nicht gibt, sind unschätzbar bei der Haltung und der
Untersuchung einer großen Zahl an Mutanten. Der größte Vorteil des Zebrafischs
liegt aber in der Art seiner Embryonalentwicklung. Zebrafischeier werden
synchron befruchtet, durchlaufen eine sehr schnelle Entwicklung außerhalb
des Mutterleibs und sind, was am wichtigsten ist, zu Beginn ihrer Entwicklung
vollkommen durchsichtig. Dieser Umstand ermöglicht die direkte Beobachtung
vieler sich entwickelnder Gewebe und Organe im lebenden Embryo und während
späterer Entwicklungsphasen, ohne daß der Embryo fixiert, geklärt oder gefärbt
werden müßte (Abb.4) (55).
Die frühe Embryonalentwicklung des Zebrafischs ist ganz anders
als die der Fliege. Beim Zebrafisch führt eine Phase schneller, synchroner
Teilungen zur Bildung einer dreidimensionalen Blastoderm des Drosophila -Embryos
unterscheidet. Beim Fisch kommt es während der Gastrulation zu mehreren morphogenetischen
Bewegungen, z.B. der Involution mesendodermaler Regionen und dorsalen Konvergenz
(55). Diese Bewegungen könnten, so unterschiedlich sie auf den ersten Blick
auch sind, mit der Invagination mesodermaler und endodermaler Anlagen sowie
der ventralen Kondensation und dem Ausstrecken des Keimstreifens im Drosophila
-Embryo in Beziehung stehen. Die Gastrulationsbewegungen führen letztlich
zur Bildung eines mehrschichtigen Fischembryos, der Pharyngula, der der typischen
Organisation des Wirbeltierkörpers entspricht und deshalb auch phylotypisches
Stadium genannt wird (Abb.4).
Untersuchungen des Anlageplans von Drosophila -Embryonen in frühen
Gastrula-Stadien haben zur Erstellung zweidimensionaler Pläne geführt, die
nichtüberlappende und klar abgegrenzte Anlageregionen zeigen. Beim Fisch
ist das Zellschicksal innerhalb definierter, räumlichere Bereiche der Gastrula
viel weniger genau vorhersagbar. Die Fischgastrula besteht aus mehreren Zellschichten:
Große Bereiche, aus denen sich unterschiedliche Gewebe oder Organe entwickeln,
sind nicht klar voneinander getrennt und liegen zum Teil übereinander. Dieser
Unterschied könnte bedeuten, daß verschiedene Mechanismen das Schicksal von
Zellen im Fisch- und Fliegenembryo während der Entwicklung bestimmen. Ein
Vergleich der Anlagenpläne von Fliege und Fisch zeigt außerdem gravierende
Unterschiede in den relativen Größen der Bereiche, die von den Anlagen der
einzelnen Organe in Anspruch genommen werden: So ist die Anlage der Hirnstrukturen
in der Fischgastrula sehr groß, während die Epidermisanlage, die im Anlagenplan
der Fliegenembryonen dominiert, beim Fisch relativ klein ist. Bis zu einem
gewissen Grad spiegeln die Anlagengrößen die Bedeutung und die Sichtbarkeit
der Strukturen wider, nach denen man sich bei der Suche nach Mutanten richten
kann.
Abbildung 1 zeigt das Kreuzungsschema zur Herstellung von Mutanten,
die einen sichtbaren Phänotyp im Embryo oder der frühen Fischlarve zeigen.
Bei Fischen wurde bei Ethylnitrosoharnstoff (ENU-)Behandlung von Spermatogonien
eine Mutagenese-Frequenz erreicht, die der von Fliegenspermien nach (Ethylmethylsulfonat)
EMS-Behandlung ähnelt (etwa eine Mutation pro Gen in 1000 Genomen) (26).Im
Unterschied zu den Fliegenmutagenesen können bei Fischen keine Marker genutzt
werden, um in der F2-Generation Träger- von Nicht-Trägerfischen zu unterscheiden.
Um eine Mutation zu finden, die in Männchen der vorherigen Generationen induziert
wurde, müssen daher eine ganze Reihe von Kreuzungen angesetzt werden, von
denen dann im Schnitt nur 25% solche Nachkommen hervorbringen, die homozygot
für die Mutation sind. Da Fische mit Hilfe eines Enzyms schlüpfen, schlüpfen
auch die meisten homozygot mutanten Embryonen und können deshalb, von wenigen
Ausnahmen abgesehen, nicht als "Nicht-Schlüpfer" erkannt werden; dagegen
ermöglichte diese Methode bei Drosophila -Mutagenesen, mutante Embryonen
zu identifizieren. Mutante Fischembryonen kann man nur an ihrem Phänotyp
erkennen. Dieser Mangel an Markern und Kriterien zur Vorselektion wird teilweise
dadurch ausgeglichen, daß das gesamte Genom auf einmal nach Mutanten abgesucht
werden kann und nicht jedes Chromosom einzeln analysiert werden muß. Bei
Drosophila wurden drei unabhängige Screens in 20 000 Inzucht-Familien durchgeführt,
wobei ungefähr 600 Mutationen in 130 Genen erhalten wurden (9-11).Beim Fisch
wurden 3.100 Familien und 4.2 Kreuzungen pro Familie untersucht, was der
Analyse von 3800 Genomen entspricht (Abb.1)(29). Da das Halten einer so großen
Zahl von Fischfamilien notwendig war, um einen zufriedenstellenden Saturierungsgrad
für jeden beliebigen Phänotyp zu erhalten, wurde das Screening bei Fischen
von zwölf Wissenschaftlern in einer gemeinschaftlichen Arbeit durchgeführt.
Wir nutzen alle phänotypischen Merkmale, die wir effektiv und sicher erkennen
konnten. Es wurden insgesamt 1200 Mutanten isoliert, von denen bis jetzt
ungefähr 900 sowohl phänotypisch als auch genetisch charakterisiert worden
sind. Sie definieren 350 Gene, von denen 150 mehr als ein Allel haben (29).
Die einzelnen Eigenschaften der Fischembryonen wurden zu unterschiedlichen
Zeitpunkten der Entwicklung untersucht, da die Strukturen und Organe jeweils
erst von einem bestimmten Alter an sichtbar werden (Abb.4). Am zweiten Tag
der Entwicklung wurden die Somiten, die Chorda und das Gehirn untersucht,
Herz, Blut, Muskulatur, Flossen, Augen, Ohren und weitere Merkmale erst nach
dem Schlüpfen. Die Fischlarven haben im Alter von fast einer Woche (als sie
zuletzt untersucht wurden) einen vollständigen Satz innerer Organe, wie Leber,
Darm, Pankreas und Niere, können sehen und auf Reize reagieren und haben
drei Arten von Pigmentzellen. Sie weisen ein Pigmentierungsmuster auf, das
immer noch für das Larvenstadium charakteristisch ist, und der Aufbau der
Flossen entspricht noch nicht ganz dem bei erwachsenen Fischen (Abb.4). Es
gibt Strukturen beim Fisch, die sicher und leicht erkannt werden können,
während andere weniger offensichtlich sind; demzufolge wurden Defekte in
ihnen vielleicht nicht immer von uns entdeckt. Bei Fischen ermöglicht der
hohe Grad an Komplexität, der bei weitem größer ist als der des Musters der
larvalen Fliegencuticula, die Untersuchung eines viel breiteren Spektrums
an Organen und Geweben, aber er stellt auch beträchtliche Anforderungen an
das Geschick und die Fähigkeiten des Experimentators. Das Erkennen eines
Phänotyps wird wesentlich erleichtert, wenn eine unmittelbare Interpretation
des Phänotyps möglich ist oder eine ähnliche Mutante mit ähnlichem Phänotyp
bereits früher isoliert wurde. Viele Mutanten haben relativ unspezifische
Defekte und wurden nicht für weitere Analysen aufbewahrt (29). Mutanten mit
komplexen oder nur sehr schwach ausgeprägten Phänotypen, die relativ unspezifischen
Defekten ähneln, wurden sicherlich nicht immer als interessant erachtet oder
richtig interpretiert. Das bedeutet auch, daß sich der grad der Saturierung
innerhalb unterschiedlicher Phänotypklassen unterscheidet (Tabelle 3). Im
Mittel ist er bei Fischen mit Sicherheit geringer als der, der bei Fliegenmutagenesen
erreicht wurde.
Anhand ihrer markantesten phänotypischen Merkmale wurden Gene
mit verwandtem Phänotyp in Gruppen zusammengefaßt. Die Klassifizierung jeder
Mutante hängt von der auf ihrem Phänotyp basierenden Interpretation ab und
diese davon, wie gut der Phänotyp analysiert werden kann. Beim Fisch gibt
es eine Reihe molekularer Sonden, die zu bestimmten Entwicklungszeiten als
Marker für einige Regionen dienen können. Die Expressionsmuster solcher stadienspezifischer
Marker war bei der Charakterisierung vieler mutanter Phänotypen sehr nützlich.
Die unterschiedlichen Klassen der anhand ihres Phänotyps identifizierten
Gene sind in Tabelle 3 gezeigt. Einige wenige dieser Klassen zeigen Parallelen
zu Gruppen von Fliegengenen, während der Großteil der Phänotypen neu ist.
Die Gesamtheit der Fischgenklassen ist so verschieden von der der Fliegengene,
daß ein Vergleich nur in wenigen Fällen sinnvoll ist. Betrachtet man aber
die bekanntesten Klassen der Fliegengene, die der Gastrulations- und Segmentierungsgene,
könnte eine kleine Zahl von Fischgenen für ähnliche Prozesse verantwortlich
sein wie bei Fliegen.
Die Gengruppen beim Zebrafisch
Gastrulationsdefekte findet man bei zwei Gengruppen, deren Phänotypen
zu einer teilweisen Dorsalisierung oder Ventralisierung des Embryos führen
(56,57). Bei mutanten dino-Embryonen sind dorsoanteriore Strukturen verkleinert,
ventrale und posteriore dagegen vergrößert, so daß Embryonen mit kleinen
Köpfen und vergrößerten Schwänzen gebildet werden. Der Defekt ist am ausgeprägtesten
bei Strukturen, die sich von der ventralsten Position des Anlageplans ableiten:
beim blutbildenden Gewebe und bei der ventralen Schwanzflosse, die in dino
vervielfacht sind. Mit molekularen Markern, die noch vor Gastrulationsbeginn
polar exprimiert werden, konnte gezeigt werden, daß der Anlageplan bereits
zu einem frühen Zeitpunkt der Embryonalentwicklung verändert ist (Abb.5A).
Wie die charakteristische Verdopplung der ventralen Schwanzflosse in mutanten
mercedes-Embryos nahelegt, spielt dieses Gen eine Rolle im gleichen Prozeß
(Abb.5K) (56). Der Phänotyp von Mutanten, die Gene mit dorsalisiertem Phänotyp
enthalten, ist zu dem von dino und mercedes komplementär. Swirl-Embryonen
z.B. haben ein stark verbreitetes paraxiales Mesoderm, und die sich bildenden
Somiten umgeben den ganzen Embryo (Abb.5F). Ventrale Strukturen, wie Blut
und die ventrale Schwanzflosse, sind verkleinert oder fehlen ganz (57). Diese
Gengruppen erinnern an jene mit dorsalisierten oder ventralisierten Phänotypen
in Drosophila. Bei Fröschen und Fischen wurden Gene kloniert, die zu den
Drosophila-Genen der ventralisierten und dorsalisierten Gruppen homolog sind
und in gegenüberliegenden Regionen der Blastula exprimiert werden (58-61).
Diese und andere Befunde führten dazu, daß eine alte Theorie wieder aufgegriffen
wurde: Diese postuliert, daß die Orientierung der dorsoventralen Achse bei
Invertebraten, verglichen mit der der Wirbeltiere, invertiert ist (62-64).
Die Fischgene sind wahrscheinlich Teil dieser konservierten Genkaskaden.
Das Interesse am Mechanismus der Segmentierung bei Wirbeltieren
war ein wichtiger Anreiz für die Suche nach Mutanten bei Fischen. Im Unterschied
zu Fliegen, deren Ektoderm klar segmentiert ist, ist bei Vertebraten in erster
Linie das Mesoderm in einem metameren Muster organisiert. Beim Fisch fanden
wir nur wenige Gene, die den Segmentierungsgenen bei Fliegen ähnlich sind.
Am ähnlichsten sind Mutanten, bei denen die Somiten fusioniert sind; Somiten
sind die im Fischembryo am frühesten erkennbaren repetitiven Strukturen,
die sich nach zehn Stunden Embryonalentwicklung zu bilden beginnen. Fünf
Gene haben einen Phänotyp mit fusionierten Somiten (Abb. 5B, M, N)(65). Das
Segmentmuster der Somiten im Fischembryo ist viel weniger komplex als das
der Drosophila-Larve. Die in postlarvalen Stadien entstehenden Wirbelkörper
zeigen in einigen mutanten Fischen charakteristische, spiegelbildliche Verdoppelungen
(Abb.5N), auch wenn diese weniger auffällig und regelmäßig sind als die der
Phänotypen der Segmentpolaritätsgene, mit denen diese Fischmutanten am ehesten
verglichen werden können. Bei unseren Fischmutagenesen konnten wir keine
Gene identifizieren, die deutliche Ähnlichkeiten zu den Gap- oder Pair-rule-Genen
aufweisen. Auch mit molekularen Ansätzen sind bis jetzt keine Homologen der
Gap-Gene gefunden worden, und die Homologen der Pair-rule-Gene scheinen nicht
in einer für Pair-rule-Gene typischen Weise exprimiert zu werden (59). Der
Umstand, daß wir beim Fisch keine Gap- und Pair-rule-ähnlichen Mutationen
gefunden haben, könnte bedeuten, daß sich die Bildung der metameren Muster
bei Drosophila von der der meisten anderen Tiere unterscheidet. doch könnte
dies auch auf Redundanz beruhen.
Andere Mutationen betreffen die Unterteilung der Somiten entlang
der dorsoventralen Achse durch das horizontale Myoseptum. Einigen dieser
Mutanten fehlt auch die Chorda, die bei anderen normal zu sein scheint. Die
Chorda ist eine Vertebraten-spezifische Struktur. Das Gen no tail, ein Fischhomologes
des Brachyury- oder T-Gens der Maus, wird in der Chorda exprimiert (Abb.
5C)(66,67) (ein Drosophila-Homologes wird im Hinterdarm exprimiert (68));
wir haben Mutationen sowohl in no tail als auch in drei anderen Genen identifiziert,
die für die Bildung der Chorda notwendig sind (Abb. 5C) (69,70). Die Somitenstruktur
bei Fischen hängt wahrscheinlich von Signalen ab, die von der Chorda ausgehen.
Gene, die die Unterteilung der Somiten durch das horizontale Myoseptum beeinflussen,
könnten an diesen Signalprozessen beteiligt sein (Abb. 5G). Ihre Proteinprodukte
sind möglicherweise am Aussenden oder am Empfang dieser Signale beteiligt
(65). Für diese Gene gibt es offensichtlich keine homologen Prozesse bei
Drosophila.
Eine große Zahl von Fischgenen beeinflußt Strukturen und Funktionen
des zentralen Nervensystems (ZNS) und der Sinnesorgane (Tabelle 3). Diese
Genklasse ist bei Fliegen nicht sehr groß. Bei Fischen wurden unterschiedliche
Aspekte der ZNS-Entwicklung untersucht. Homologe der neurogenen Drosophila-Gene,
z.B. notch und delta, wurden bei Wirbeltieren durch molekulare Methoden identifiziert
(71), und während unserer Mutagenese wurde zumindest ein Gen mit neurogenen
Eigenschaften, white tail, entdeckt. Bei mutanten Embryonen tritt eine beträchtliche
Vervielfältigung primärer Neurone auf Kosten sekundärer Neuronen und einige
Arten von Gliazellen auf (Abb. 5E)(72). Eine andere Gruppe von Genen beeinflußt
Strukturen in allen drei Keimblättern entlang der Mittellinie des Embryos.
In Mutanten sind oft die Augen fusioniert. Außerdem fehlen mutanten Embryonen
manche Strukturen, die vom axialen Mesoderm und von ventralen Bereichen des
ZNS oder des Gehirns stammen. In einigen Mutanten ist das korrekte Auswachsen
der Nerven über die Mittellinie hinaus gestört. Der wichtigste und am längsten
bekannte Repräsentant dieser Klasse ist das Gen cyclops (73). Mutante cyclops-Embryonen
haben anterior fusionierte Augen, und die Bodenplatte, der ventralste Bereich
des ZNS, fehlt. Neu identifizierte Gene dieser Klasse sind z.B. schmalspur
und chameleon (74). Es wird interessant sein zu sehen, ob Mutationen, wie
spitz und andere (75), die die Strukturen der Mittellinie bei Drosophila
(ventrale Regionen des Neuroektoderms und des Kopfs) deletieren, den Genen
homolog sind, die die Mittellinie bei Fischen beeinflussen.
Die morphologie des Gehirns ist bei einer Reihe von Mutanten
betroffen, von denen nur einige hier erwähnt werden. Das Vorderhirn, einschließlich
er Riechplakoden und der Augen, fehlt völlig in der Mutante masterblind (Abb.
5D). Die Analyse durch molekulare Marker ergab, daß die Region, die sich
normalerweise zum Vorderhirn entwickelt, statt dessen zu stärker posterioren
Strukturen wird, ähnlich einer homöostatischen Transformation (76). Die Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze
fehlt bei Mutanten der beiden Gene no isthmus und acerebellar. Das Gen no
isthmus (Abb. 5L) , das auch für die Bildung der Niere notwendig ist, ist
einem der pax-Gene homolog, die ursprünglich bei Mäusen wegen ihrer Homologie
zu dem Drosophila-Gen paired entdeckt wurden (77).
Viele der Zebrafisch-Genklassen zeigen keine Parallelen zu denen
unserer Drosophila-Mutanten und werden an dieser Stelle nur zusammenfassend
erwähnt. Von besonderem Interesse angesichts ihrer Bedeutung für die medizinische
Forschung sind Mutanten, bei denen innere Organe betroffen sind. Wir identifizierten
eine Reihe von Genen, die an der Bildung des Bluts, des Kreislaufs und des
Herzens beteiligt sind, die in den ersten beiden Tagen der Fischembryonalentwicklung
sehr einfach untersucht werden können. Mutanten, bei denen die sich später
entwickelnden Organen, z.B. Leber, Pankreas und Niere, betroffen sind, wurden
weniger häufig gefunden. Mutationen anderer Gene führen zu Differenzierungsdefekten
oder Degenerationserscheinungen der Muskulatur sowie der Sinnesorgane (Auge
und Ohr; Abb. 51). Eine große Zahl von Genen ist zur Bildung von Strukturen
nötig, die von Neuralleistenzellen stammen. Die größte Klasse dieser Gene
ist für die Pigmentierung erforderlich, d,h, für die Bildung der Pigmentzellen
und des Pigmentmusters. Einige Gene wirken sich auf Teile des Kiefers (Abb.
50) oder der Kiembögen aus, die jeweils nur bei Wirbeltieren vorkommen (Tabelle
3). Wir isolierten auch Mutanten, die spezifische Bewegungsdefekte der Larve
aufweisen. Mutante Larven reagieren nicht auf Berührung, bewegen sich wenig
oder gar nicht, zeigen ein spastisches oder kreiselndes Bewegungsverhalten
und haben Defekte in der reziproken Inhibierung der Muskelkontraktionen über
die Körpermittellinie. Bei einigen wenigen Mutanten wurden Defekte beim Auswachsen
der Motoneurone beobachtet (78). Bei Drosophila konnten Bewegungsmutanten
nicht durch unsere Mutagenesen identifiziert werden, obwohl bewegungsunfähige
larvale Phänotypen prinzipiell anhand einer anomalen Verdrehung der larvalen
Cuticula im ungeschlüpften Embryo erkannt werden können. Eher zufällig wurde
bei Larven, die ein hyperaktives Verhalten zeigten und sich manchmal in ihrer
Eihülle umdrehten, eine kleine Gruppe von vier Drosophila-Genen entdeckt
(Tabelle 2)(9-11). Diese Phänotypen weisen darüber hinaus eine defekte Differenzierung
des Kopfskeletts aus, sind aber bis heute nicht genauer untersucht.
Zusammenfassung
Die genetische Untersuchung der embryonalen Achsenfestlegung
bei Drosophila hat zum wahrscheinlich vollständigsten Verständnis eines Musterbildungsprozesses
bis heute geführt. Die Eleganz und Effizienz, mit der bei diesem Organismus
Mutationen isoliert und Gene manipuliert werden können, werden weitere wichtige
Entdeckungen hinsichtlich einer Reihe grundlegender Prozesse der Zell- und
Entwicklungsbiologie ermöglichen. Jedoch sind manche Mechanismen bei der
Fliege wahrscheinlich einzigartig für diesen speziellen Organismus. Die Verwendung
von Fliegengenen ist ein sehr wichtiger Ansatz zur Identifizierung homologer
Gene bei Vertebraten, der sich auf die Ähnlichkeit zwischen diesen so offensichtlich
unterschiedlichen Organismen stützt. Um die Entwicklung von Wirbeltieren
zu verstehen, müssen zusätzlich zu den Genen, die Fliegen und Fischen gemeinsam
sind, vor allem die Wirbeltier-spezifischen Gene untersucht werden. Um Unterschiede
zu finden und sie erklären zu können, sind die beim Zebrafisch gefundenen
Mutanten ein wichtiger Ausgangspunkt, von dem aus fundamentale biologische
und medizinische Probleme mit genetischen Mitteln untersucht werden könnten.
Ich
möchte meinen Mitarbeitern für ihr mitwirken danken: für ihr Geschick, ihr
Verständnis, für ihre Gedanken und ihr großes Können, für ihre Geduld, ihren
Enthusiasmus und für ihre Unterstützung. Auch möchte ich Siegfried Roth,
Stefan Schulte-Merker, Stefan Meyer, Darren Gilmour, Nancy Hopkins, Peter
Overath, Michael Granato und Judith Kimble für Kritik und Hilfe bei der Fertigstellung
dieses Manuskripts danken. Übersetzt von Dr. Stefan Schulte-Merker, Tübingen